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1539年，土耳其艦隊攻擊並摧毀了利馬索爾（Limassol）。
由於擔心日益擴張的奧斯曼帝國，威尼斯加強了法馬古斯塔（Famagusta）、尼科西亞（Nicosia）和基爾尼亞（Kyrenia）的防禦，但大多數其他城市卻易於被攻陷。
到1563年，威尼斯的人口已降至約16.8萬人。
1570年夏季，土耳其人再次發起進攻，但這次是全面入侵，而非突襲。
約6萬名軍隊，包括騎兵和炮兵，在穆斯塔法·帕夏（Mustafa Pasha）的指揮下，於1570年7月2日無阻地登陸在利馬索爾附近，並對尼科西亞發起圍攻。
在城市陷落的那一天，即1570年9月9日，2萬名尼科西亞居民被處死，所有教堂、公共建築和宮殿都遭到洗劫。
屠殺的訊息迅速傳播，幾天後，穆斯塔法毫無抵抗地攻佔了基爾尼亞。
然而，法馬古斯塔進行了抵抗，防禦持續到1570年9月直至1571年8月。
法馬古斯塔的淪陷標誌著塞普勒斯進入奧斯曼時期。
兩個月後，由威尼斯、西班牙和教皇艦船組成的聖聯盟海軍，在奧地利的唐·胡安（Don John of Austria）指揮下，在勒班託戰役（battle of Lepanto）中擊敗了土耳其艦隊。
儘管在海上戰勝了土耳其人，塞普勒斯仍在接下來的三個世紀中處於奧斯曼統治之下。
到1575年，威尼斯的人口約為17.5萬人。
但部分由於1575到1576年的瘟疫，到1581年，人口降至12.4萬人。
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根據經濟歷史學家揚·德·弗里斯（Jan De Vries）的說法，到17世紀初，威尼斯在地中海的經濟實力已經顯著下降。
德·弗里斯將這種衰退歸因於香料貿易的喪失、競爭力下降的紡織工業、復興的天主教會在圖書出版方面的競爭、三十年戰爭對威尼斯主要貿易伙伴的不利影響，以及棉花和絲綢進口成本的增加。
1606年，威尼斯與教皇國之間發生了衝突，因兩名被指控輕微犯罪的神職人員被捕，以及一項限制教會享有和獲取土地財產的法律。
教皇保羅五世（Pope Paul V）認為這些條款違反教會法，並要求廢除。
當這一要求被拒絕後，他對威尼斯施加了禁令，禁
