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生時，她是王位的第二繼承人，僅次於她的異母兄弟亨利。
當時亨利26歲，已婚但沒有子嗣。
伊莎貝拉的弟弟阿方索在1453年11月17日出生，使她的繼承位置降為第三位。
1454年，父親去世後，亨利作為亨利四世登上王位。
伊莎貝拉和阿方索在亨利的照顧下生活。
隨後，伊莎貝拉、母親和阿方索搬到了阿雷瓦洛（Arévalo）。
這些年對伊莎貝拉來說是動盪的。
她在阿雷瓦洛的城堡生活條件較差，缺乏資金。
儘管她的父親在遺囑中安排了充足的財政支援，但亨利國王並未遵循父親的遺願，或許是出於對異母兄弟的限制欲或無能。
儘管生活條件艱難，伊莎貝拉在母親的監督下接受了關於虔誠和宗教信仰的教育。
當國王亨利四世的妻子葡萄牙的瓊（Joan of Portugal）即將生下他們的女兒喬安娜時，伊莎貝拉和她的兄弟阿方索被傳喚到塞戈維亞的宮廷，在國王的直接監督下完成教育。
阿方索由家庭教師照顧，而伊莎貝拉則成為王后的侍女之一。
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在塞戈維亞，伊莎貝拉的生活條件有所改善。
她總能得到食物和衣物，住在有金銀裝飾的城堡中。
伊莎貝拉的基礎教育包括閱讀、拼寫、寫作、語法、歷史、算術、藝術、國際象棋、舞蹈、刺繡、音樂和宗教教育。
她與侍女們透過藝術、刺繡和音樂來娛樂自己。
雖然她的生活相對輕鬆，但由於亨利國王的禁令，她很少離開塞戈維亞。
雖然她的異母兄弟讓她遠離王國的政治動盪，但伊莎貝拉對發生的一切及她在紛爭中的角色有了充分的瞭解。
在謠言傳播開後，喬安娜實際上並不是亨利國王的女兒，而是皇室寵兒貝爾特朗·德·拉·庫埃瓦（Beltrán de la Cueva） 的女兒，貴族們向亨利國王施壓，要求任命國王同父異母的弟弟阿方索為繼任者。
他們甚至要求阿方索奪取王位。
控制阿方索的貴族們與亨利的軍隊在1467年進行的奧爾梅多之戰（Second Battle of Olmedo）中交戰，結果為平局。
亨利國王同意承認阿方索為他的法定繼承人，條件是他必須娶自己的女兒喬安娜。
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