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作為神聖羅馬帝國皇帝，查理於1521年召集馬丁·路德前往沃爾姆斯議會，並承諾給予他安全通行的保證條件。
路德出席後，為《九十五條論綱》和他的著作進行了辯護。
查理評論道：“那個修士永遠不會讓我變成異端。”
查理五世依靠宗教統一來治理他各個不同的領土，因為這些領土只有透過他的個人統治才得以統一，因此他將路德的教義視為一種具有破壞性的異端。
他將路德宣佈為不法之徒，併發布《沃爾姆斯敕令》，宣告：
“你們知道，我是偉大的德意志民族的最虔誠皇帝、天主教西班牙國王、奧地利大公和勃艮第公爵的後裔。
他們一生都忠實於羅馬教會……在他們去世後，按照自然法和繼承法，他們將這些神聖的天主教儀式傳給了我們，讓我們遵循他們的榜樣生活並死去。
所以，直到現在，我一直是我們祖先的忠實追隨者。因此，我決心維持這些我祖先所建立的制度，直至今日。”
然而，查理五世信守承諾，允許馬丁·路德自由離開這座城市。
薩克森選侯兼路德的保護者腓特烈三世對沃爾姆斯議會的結果感到遺憾。
在從沃爾姆斯返回的途中，路德被腓特烈的手下綁架，並被藏在遠處的瓦爾特堡。
在那裡，他開始進行聖經的德語翻譯工作。
路德宗的傳播導致了兩場主要的起義：1522-1523年的騎士起義和1524-1525年由托馬斯·閔采爾領導的農民起義。
儘管支援帝國的施瓦本同盟與害怕社會動亂的新教諸侯聯手恢復了秩序，查理五世還是透過赦免的方式維持了和平。
在此之後，查理五世採取了寬容的態度，開始追求與路德宗的和解政策。
1530年的奧格斯堡帝國議會是查理五世召集的，旨在討論三個問題：
首先是對抗奧斯曼威脅的帝國防禦；
其次是與政策、貨幣和公共福利相關的問題；
第三是基督教的分歧，試圖達成某種妥協並處理德國的局勢。
議會由皇帝於6月20日正式開啟。
會議產生了許多成果，其中最為重要的是1530年由路德宗諸侯提出的奧格斯堡信綱（Confessio Augustana），這是路德宗的核心檔案。
路德的助手菲利普·梅蘭希通更進一步，親自將信綱提交給查理五世
