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皇帝堅決拒絕了它，1531年，新教諸侯組成了施馬爾卡爾登聯盟。
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1532年，查理五世承認了該聯盟，並透過紐倫堡暫緩條約有效地暫停了《沃爾姆斯敕令》。
該條約要求新教徒繼續參加對抗土耳其人和法國的帝國戰爭，並將宗教事務推遲到由教皇召集的大公會議解決。
由於教皇推遲組織大公會議，查理五世決定組織一次德國峰會，並於1541年主持了天主教徒與路德宗的雷根斯堡會議，但未能達成妥協。
1545年，特倫託會議終於召開，反宗教改革也由此開始。
該天主教倡議得到了神聖羅馬帝國一些諸侯的支援。
然而，施馬爾卡爾登聯盟拒絕承認會議的合法性，並佔領了天主教諸侯的領土。
因此，查理五世宣佈施馬爾卡爾登聯盟為非法，並於1546年對其發動了戰爭。
次年，他的軍隊將聯盟的軍隊驅逐出德國南部，並在繆爾貝格戰役中擊敗了薩克森選侯約翰·腓特烈和黑森的菲利普，俘虜了兩人。
在1548年的奧格斯堡臨時和議中，查理提出了一項解決方案，允許新教徒享有一些特權，直到特倫託會議恢復統一。
然而，雙方的成員都對這項臨時協議表示不滿，甚至有些人積極反對它。
1550年，大公會議重新召開，並有路德宗的參與。
查理五世將帝國宮廷設在奧地利的因斯布魯克，以便他能夠密切關注會議的進展。
1552年，新教諸侯聯合法國國王亨利二世再次叛亂，第二次施馬爾卡爾登戰爭爆發。
曾在第一次衝突中為帝國勝利立下戰功的薩克森的毛裡茨轉而支援新教陣營，並繞過帝國軍隊，直接進軍因斯布魯克，企圖俘虜皇帝。
查理五世在痛風發作時被迫逃離該市，勉強在半昏迷狀態下乘坐擔架逃到菲拉赫，並僥倖保命。
查理五世未能從法國手中奪回梅斯，隨後他回到低地國家度過了他的最後幾年皇帝生涯。
1555年，他指示他的弟弟斐迪南以他的名義簽署奧格斯堡和約。
這一協議導致德國在宗教上分裂為天主教和新教的諸侯國。
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