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騎士團直到1530年才擁有自己的領土,當時大團長菲利普·德·維利耶(Fra' Philippe de Villiers de l'Isle Adam)佔領了馬耳他島(Malta)。
該島是由神聖羅馬皇帝查理五世和他的母親卡斯蒂利亞女王瓊娜(Queen Joanna of Castile)以西西里國王的身份授予騎士團的,得到了教皇克萊門特七世(Pope Clement VII)的批准,騎士團因此需遵守《馬耳他獵鷹的貢品》(Tribute of the Maltese Falcon)的條件。
在1565年,騎士們在大團長讓·德·瓦萊特(Fra' Jean de Valette,曾在土耳其船上和德拉古特一起划槳)的領導下,成功防禦了奧斯曼帝國的圍攻,持續了三個多月。
騎士團的艦隊在1571年的萊班託海戰(Battle of Lepanto)中對奧斯曼海軍力量的最終摧毀做出了貢獻,該戰役由西班牙國王菲利普二世(King Philip II of Spain)的異母兄弟奧地利的約翰(John of Austria)指揮。
宗教改革將西歐分裂為新教和天主教國家,對騎士團也產生了影響。
在包括英格蘭、蘇格蘭和瑞典在內的多個國家,騎士團解散。
在其他國家,如荷蘭和德國,部分司法區或指揮部(騎士團的行政區劃)經歷了新教轉變。
這些“約翰騎士團”在德國、荷蘭、瑞典以及包括美國和南非在內的許多其他國家存續下來。
騎士團被確立為在任何基督教國家之間的戰爭中保持中立。
從1651年到1665年,騎士團統治了加勒比海的四個島嶼。
在1651年5月21日,它購買了聖巴瑟米島(Saint Barthélemy)、聖基督山(Saint Christopher)、聖克魯瓦島(Saint Croix)和聖馬丁島(Saint Martin)。
這些島嶼是從剛剛解散的法國外島公司(Compagnie des ?les de l'Amérique)手中購買的。
到1665年,這四個島嶼被出售給了法國西印度公司(French West India Company)。
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1798年,拿破崙領導法國佔領馬耳他